Técnica De Diagnostico Inmunologico

Introducción.

Hoy en día gracias a los avances tecnológicos se ha podido desarrollar una serie de técnicas que ayudan al diagnóstico de múltiples enfermedades. En cuanto al tema de las enfermedades autoinmunes, las técnicas inmunológicas desarrolladas son de gran ayuda ya que se pueden detener los anticuerpos a través de muestras con volumen pequeños.

Algunas de estas técnicas inmunológicas son rutinarias, mientras que otras se realizan en laboratorios especializado en el diagnostico biológico de enfermedades inmunológicas (autoinmunes, infecciosas, virales, o micóticas).

La reacción antígeno-anticuerpo, ha sido utilizada como la base de muchos procedimientos diagnósticos. Dependiendo del test, se puede detectar o cuantificar un antígeno especifico o un anticuerpo especifico. La detección de un antígeno especifico se aplica al diagnóstico de enfermedades infecciosas, neoplasias , cuantificación de hormonas , drogas etc.

La cuantificación de anticuerpos específicos se utiliza en el diagnóstico de infecciones , alergias, enfermedades autoinmune e inmunodeficiencias .

Enzimainmunoanalisis (EIA)

El enzimainmunoanálisis (EIA) es una metodología que permite cuantificar anticuerpos o antígenos en muy baja concentración (menos de 1 ng/ml) en la mayoría de los líquidos biológicos y sobrenadantes de cultivos celulares. Se ha usado ampliamente en el estudio de la respuesta de anticuerpos frente antígenos complejos. En el laboratorio de inmunología se utiliza corrientemente para detectar y cuantificar autoanticuerpos y diversas proteínas e inmunoglobulinas en baja concentración en los líquidos biológicos.

De acuerdo a lo anterior el EIA puede aplicarse a una amplia gama de situaciones, entre las que destacan las siguientes:

- Apoyo diagnóstico a enfermedades autoinmunes

- Diagnóstico de enfermedades infecciosas.

- Diagnóstico de enfermedades alérgicas

- Estudio de marcadores tumorales

- Cuantificación de proteínas circulantes en baja concentración

- Niveles plasmáticos de drogas y hormonas.

El enzimainmunoanálisis se basa en dos fenómenos biológicos: la alta especificidad del anticuerpo por su antígeno y la amplificación de la unión antígeno-anticuerpo por reacciones químicas llevadas a cabo por enzimas. Por tanto, esta metodología consiste en una reacción inmunológica y una indicadora enzimática. El EIA en fase líquida sin etapas de separación, se conoce como sistema homogéneo, ejemplo, el EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique). El EIA en fase sólida requiere etapas de separación y recibe el nombre de sistema heterogéneo, ejemplos, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), MEIA (EIA en micropartículas).

Elisa

La técnica ELISA (Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase solida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectrofotométricamente. Este principio tiene mucho de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, empleas reactivas económicas y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y de la fracción libre.

Técnicas de ensayo

Directo: Las placas de Elisa se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestran del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, etc.) pero en las que se tenga certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien donde se le ha añadido).

Indirecto: Las placas Elisa se preparan de una forma idéntica a la directa. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debido a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo mas popular, como es la inmunoflorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.

Sándwich (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos): Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la en la que se encuentra el antígeno, que se ha retenido en el pocillo al ser reconoció por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

Fases de un ensayo ELISA

1.- Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa fosfatasa alcalina): El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sándwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.

2.- Unión de antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos: La unión de anticuerpo o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad con proteínas.

3.- Formación de una o mas capas inmunocomplejos: En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un segundo antígeno primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o mas anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado se ensayan diferentes relaciones de antígeno frente a una cantidad de antígeno marcado.

4.- Revelado de la reacción enzimática: Después de un lavado para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reacción y se lee la densidad óptica (D.O) espectrofotometría.

Dispositivos empleados en ELISA

Se han ensayado numerosas fases solidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a los actuales micros placas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de absorción (en su superficie) de moléculas y con fondos de pocillos ópticamente claros para poder realizar medidas de densidad óptica en instrumentos específicos.

Espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores de ELISA.

Actualmente se han desarrollado dispositivos de mayor capacidad, por ej. Con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de “screening” masivo de los sistemas roboticados (HTS, “high-throghput systrm”).

Los lectores de ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtro que solo permiten la lectura de uno o pocas longitudes de onda. Son lo que se corresponde con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados.

Equipos requeridos

1.- Un analizador de ELISA.

2.- Un lavador de ELISA.

3.- Un sistema dispensador de líquidos, (pueden usarse pipetas multicanal).

4.- Una incubadora especializada para las placas.

RIA

El radioinmunoanálisis (RIA) consiste en una técnica de laboratorio de análisis clínico. Usa isotopos radiactivos, es invitro, es decir, se extrae la sangre del paciente y es analizada para ver sustancias.

Es una técnica que nace en los años 60-70, propiciando un gran avance de la endocrinología. Es una técnica muy sensible, mide pequeñas cantidades de sangre. Cualquier sustancia del organismo puede ser considerada un antígeno. Los antígenos que se transforman sirven para medir la cantidad de hormonas que hay en el organismo. Así se miden:

• Hormonas peptidicas: T3-T4-TSH-GH…, casi todas las hormonas hipofisarias.

• Hormonas no peptidicas: estrógenos, testosterona… hormonas sexuales.

• Sustancias no hormonales que pueden considerarse como antígeno: marcadores tumorales digoxina, medicamentos.

Usos del radioinmunoanálisis

Se utiliza como herramienta en el diagnostico de laboratorio; medición de hormonas, detección de antígenos para determinar infecciones.

Métodos de separación

1.- Adsorción: Con carbón activo, dextrano o resinas adsorben (se unen) específicamente la fase libre (antígeno

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