Microbiología

PRÁCTICA Nº2

 TEMA:

Coloración GRAM y Coloración BAAR.

 OBJETIVOS:

• Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram.

• Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, al igual de la aplicabilidad clínica de la tinción.

• Entender los pasos necesarios para realizar la tinción de BAAR.

• Buscar los microorganismos Esporas, así como la aplicabilidad clínica de la tinción.

 MATERIALES:

 METODOLOGÍA:

 DE ESTUDIO: Se trata de un estudio de tipo descriptivo.

 INSTRUMENTOS: Placas, tinciones, microscopio, cuaderno de apuntes y esferos.

 MÉTODOS:

1) Descriptivo: Se describe el procedimiento para las diferentes tinciones.

2) Analítico: Se establece una comparación entre las tinciones para identificar las estructuras que se observan en cada placa que fue teñida.

 TÉCNICAS

El estudio se lo diseñó tomando en consideración el tipo de tinción que se utilizaba para cada muestra.

 FUNDAMENTO TEÓRICO:

TINCIÓN

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido, poblaciones celulares o para resaltar organelas dentro de células individuales.

La tinción se puede ser:

• Directa: Cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro tratamiento previo.

• Indirecta: Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que puede no ser un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que podrá atacar el colorante.

Mecanismos de Coloración

La coloración celular y tejidos son una combinación de fenómenos físicos y químicos de absorción: los fenómenos físicos de absorción, capilaridad y ósmosis participan en cierto grado. La afinidad de colorantes básicos por los tejidos ácidos y viceversa indican que hay reacción química.

Los Colorantes

Son compuestos, orgánicos que contienen radicales cromóforos esto es que producen color y grupo de anxocromos que forman sales los grupos nitrito (-NO2) y azo (-N = N) son cromóforos. Los radicales hidroxilo (-OH) y amino (-NH2) son grupos anxocromos. Los cromóforos imparten la propiedad cromógena al colorante y los anxocromos permiten que el colorante se una con la fibra o tejido.

Preparación de Frotis Bacteriano para Coloración

Antes de la tinción las bacterias suelen encontrarse en agua o en otro líquido en un portaobjeto limpio y son extendidos en una película uniforme y delgada. Se deja que la película seque en el aire y los microorganismos son fijados por sustancias químicas o por el calor moderado.

Tinciones: En las tinciones se observa morfología, estructura y agrupamientos de microorganismos.

Tipos de Tinción:

 Tinción Simple: Se habla de coloración simple cuando una muestra extendida se tiñe con un solo colorante. Si la preparación se tiñe con safranina, las bacterias adquirirían un color rojo, si se utiliza azul de metileno, se teñirán de azul, si por el contrario se tiñen con cristal violeta, las bacterias aparecerán teñidas de color violeta, es decir adquirirán el color del único colorante que se utilizó. Este procedimiento permite distinguir la morfología y estructuras internas de la célula bacteriana, como por ejemplo, la presencia de endospora bacteriana. Existen coloraciones especiales que permiten poner de manifiesto estructuras bacterianas como por ejemplo: flagelo, cápsula, endosporas, etc.

 Tinción de Gram: Es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gran positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gran negativa a las que se visualizan de color rosa.

 Tinción Ácido Resistente: Una vez teñidos, conservan su color resistiendo al lavado con ácido mineral reducido. En esta tinción las bacterias ácido resistentes conservan el colorante primario color rosa o rojo, los demás microorganismos son decolorados por el ácido y toman el color azul.

 Tinción de Giemsa: Es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las ricketsias localizadas dentro de la célula huéspedes. La coloración de giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la técnica de citoconcentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parásito principal, con excepción de los trofozoitos jóvenes y el plasmodium falciparum. También se emplea la modificación de Wright. Este método de tinción permite también la tinción diferencial de zonas con un alto contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial.

 Tinción de Esporas: Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

 Tinción de Cápsula: Se denomina tinción negativa porque tiñe el fondo de la preparación y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tinción propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece más a una preparación en fresco.

 Tinción de Flagelos: Es un orgánulo filiforme cuya función principal (aunque no única) suele ser proveer de movimiento a las células. Este orgánulo está presente, aunque con variaciones, en células de arqueas, de procariotas y de eucariotas.

 Endoesporas: Las endosporas son células resistentes al calor y muy dificiles de destruir incluso por agentes químicos muy agresivos. Cuando estas son liberadas son capaces de permanecer en estado criptobiotico durmiente varios decenios incluso siglos.

Las endosporas son resistentes a la desecación, la radiación, los ácidos y desinfectantes químicos.

 Levaduras: Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.

 Las Capsulaas: Es la capa con borde definido formada por una serie de polímeros orgánicos que en las bacterias se deposita en el exterior de su pared celular. Generalmente contiene glicoproteínas y un gran número de polisacáridos diferentes, incluyendo polialcoholes y aminoazúcares.

Les sirve a las bacterias de cubierta protectora resistiendo la fagocitosis. También se utiliza como depósito de alimentos y como lugar de eliminación de sustancias de desecho. Protege de la desecación, ya que contiene una gran cantidad de agua disponible en condiciones adversas. Además, evita el ataque de los bacteriófagos y permite la adhesión de la bacteria a las células animales del hospedador.

 Sarcina: Son anaerobios obligados y son extremadamente ácido-tolerantes que pueden fermentar azúcares y crecer a pH inferior a 2.

Este género comprende 2 especies de bacterias que se dividen en tres planos perpendiculares para producir paquetes de 8 en una célula.

 Bacillus Cereus: La mayoría se encuentra en el suelo o en partículas de polvo en suspensión y son uno de los organismos del género Bacillus que pueden ser aislados fácilmente.

Puesto que los formadores de esporas pueden aislarse selectivamente a partir del suelo, alimentos o de otro material dejando las muestras a 80 ºC durante 10 minutos.

Los bácillus suelen crecer en medios sistemáticos que contengan azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes, etc, como única fuente de carbono y amoníaco como única fuente

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