Clasificacion FAB De Las Leucemia Mieloide Aguda

PRACTICA Nº 5 Tinción diferencial de Gram

Objetivo:

Prepararán un frotis normal, debe ser fina y uniforme para permitir el paso de la luz a través de ella, de esta forma resultará más fácil su observación en el microscopio. Una vez terminado el frotis, continuar con la tinción, pero en este caso con la tinción diferencial de Gram, empleando diversos colorantes que harán que las bacterias se tiñan de color azul (positivas) o rojas (negativas). Esto solo podrá observarse en el microscopio y la docente encargada de esta práctica determinará si la tinción fue bien realizada por los alumnos.

Introducción:

La técnica de coloración de Gram es de gran utilidad en Bacteriología, ya que permite diferenciar las bacterias en Gram Positivas y Gram Negativas. Casi la mitad de las bacterias, son Gram positivas y el resto Gram negativas.

El método fue descubierto por Christian Gram (Danés), en 1884, quien observó que en cortes histológicos que contenían bacterias coloreadas con violeta de genciana y tratadas con solución acuosa de yodo, este colorante podría ser removido del corte histológico con el empleo de alcohol, pero no de las bacterias.

Posteriormente descubrió que no todas las bacterias retenían al violeta de genciana sino que algunas eran decoloradas por acción del alcohol. A las primeras las llamó Gram positivas y a las segundas Gram negativas. Estas que quedan incoloras son teñidas luego mediante el empleo de un colorante de contraste como la safranina, para hacer posible su observación.

Existen muchas modificaciones de esta coloración, pero fundamentalmente es lo mismo.

Las bacterias Gram-positivas son microorganismos que forman parte de la biota normal de nuestro organismo; son habitantes de nuestro organismo y se encuentran dispersos en el ambiente, en la piel, mucosas e intestinos de animales. Pueden contaminar alimentos, suelos y agua (Micrococcus). Hay otros como los Staphylococcus que se encuentran en el tejido de las vías respiratorias altas: faringe, laringe y senos nasales.

En cambio las bacterias Gram-negativas son quimioorganotrofos, presentan pocos requerimientos nutricionales y son capaces de sobrevivir en medios relativamente simples. Son también anaerobios facultativos y capaces de colonizar ambientes intestinales en situaciones patológicas.

La tinción de Gram permite diferenciar a las bacterias Gram-positivas de las Gram-negativas. Toda tinción de Gram empieza por un buen frotis, ya que es la base para obtener resultados satisfactorios. El proceso es una prueba crítica para el diagnóstico presuntivo y rápido de agentes infecciosos. En esta tinción puede influenciar la edad de cultivo de la bacteria, el medio de cultivo, la atmósfera de incubación y la presencia de sustancias inhibitorias, factores que deben ser considerados para valorar la calidad de una muestra clínica.

Gram positivos Gram negativos

Materiales y reactivos

 Gradilla.

 Portaobjetos.

 Asa bacteriológica.

 Mechero Bunsen.

 Cerillos ó encendedor.

 Lápiz graso.

 Papel absorbente.

 Hisopos.

 Microscopio.

 Aceite de inmersión.

 Cristal violeta.

 Lugol.

 Alcohol acetona

 Safranina.

 Cultivos bacterianos

Procedimiento:

I. Se emplean portaobjetos perfectamente limpios y sin raspaduras para evitar interferencias en las observaciones

II. Desengrasar: Puede utilizar una torunda impregnada con alcohol, dejar secar perfectamente

III. Preparación de la extensión o frotis: Preparar 2 extensiones (frotis) en la forma ya indicada. Fijar el frotis y tener el cuidado que las extensiones sean finas y uniformes para permitir el paso de la luz a través de ellas y facilitar su observación

IV. Tinción diferencial de gram: Colocar los frotis sobre las varillas de tinción y realizar lo siguiente

1. Cubrir la extensión con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto.

2. Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la preparación y escurrir para eliminar el exceso de agua

3. Cubrir la extensión con solución de Lugol y dejar actuar por un minuto.

4. Lavar con agua corriente.

5. Decolorar con alcohol acetona aproximadamente 10 segundos

6. Lavar con agua corriente.

7. Cubrir la extensión con Safranina y dejar actuar por 1 minuto.

8. Lavar con agua corriente.

9. Secar la preparación al aire o colocándola entre papel absorbente.

10. Observar al microscopio (enfocar con 10X y reportar 100X con aceite de inmersión ).

Interpretación

 Las bacterias Gram positivas retienen

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