La Stevia

2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa de Stevia rebaudiana Bertoni es un gen funcional

Hitesh Kumar Singh Cachemira • • Sanjay Kumar

Recibido : 4 de enero 2012 / Aceptado : 1 de octubre 2012 / Publicado en Internet : 12 de octubre 2012

Springer Science + Business Media Dordrecht 2012

RESUMEN Stevia [Stevia rebaudiana (Bertoni)] es una hierba perenne que se acumula la Stevia diterpenoides dulces (SGS) en su tejido foliar. SGs se sintetizan por 2C-metil-D-eritritol 4-fosfato (MEP). De las varias enzimas de la vía MEP, 2C-metil-D-eritritol sintasa 2,4-ciclodifosfato (MDS) (codificada por MDS) cataliza la ciclación de la 4 - (citidina 5 'difosfato)-2C-metil-D-eritritol 2-fosfato en 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato.Complementación de la cepa mutante knockout MDS de Escherichia coli, EB370 con MDS putativos de stevia (SrMDS) rescató el mutante letal, lo que sugiere SrMDS para ser un gen funcional. Experimentos llevados a cabo en la cámara de crecimiento de la planta y en el campo sugirieron SrMDS ser un gen regulado luz. Ácido indol 3-acético (IAA; 50, 100 mM) hacia abajo-regulada la expresión de SrMDS en 4 h del tratamiento, mientras que, el ácido abscísico no modular su expresión. Se observó una alta expresión de SrMDS durante las horas de luz del día, en comparación con las horas de oscuridad. El presente trabajo establece la funcionalidad de SrMDS y mostró el papel de la luz y la IAA en la regulación de la expresión de SrMDS.

Palabras clave Stevia rebaudiana MEP vía Complementación ensayo de expresión génica Regulación de luz

introducción

Isoprenoides comprenden un gran grupo de más de 30.000 productos naturales presentes en los organismos vivos [ 1 , 2 ] . Estos compuestos tienen un papel importante en el sistema , tales como el componente de la cadena de transporte de electrones ( cadena lateral de plastoquinona ) , la pared celular , pigmentos fotosintéticos ( cadena lateral fitol de la clorofila , carotenoides ) , y fitohormonas ( ABA , zeatina , y giberelinas ) [ 3 ] . Todos los isoprenoides están hechos de las cinco unidades isoprenoides de carbono , isopentenil piro- fosfato ( IPP ) y su isómero pirofosfato de dimetilalilo ( DMAPP ) . La biosíntesis de IPP y DMAPP se produce a través de la vía mevalonato citosólico [ 4 , 5 ] y / o plastídica 2C - metil-D - eritritol 4 fosfato ( MEP) .

Stevia rebaudiana Bertoni , un miembro de la familia Asteraceae , es una planta nativa de los valles de los ríos Paraguay . Stevia se sabe que se acumulan tan alto como 30 % ( w / w ) de los glucósidos de esteviol dulces (SGS ) en el tejido de la hoja . SGS se glucosilada derivados de un alcohol diterpenoide steviol [ 6 ] . La mezcla de SGs incluye esteviósido , rebaudiósido A , B , C , D, E , y F y dulcósido A [ 7 ] . Fuera de 230 especies del género Stevia , SGS se ha informado sólo de S. rebaudiana , y S. phlebophyla [ 8 ] . Estos glucósidos son aproximadamente 300 veces más dulce que el azúcar de mesa común y se utilizan como edulcorante no calórico en muchos países del mundo . SGs se han reportado para bajar el nivel de glucosa en sangre postprandial(de sobremesa) de los pacientes con diabetes de tipo II y en la reducción de la presión arterial en pacientes levemente hipertensos [ 9 , 10 ] . También , esteviol y SGS se ha demostrado que tienen actividades reguladoras del crecimiento de plantas [ 11 ] .

SGs biosíntesis puede ser descrito como tres etapas principales : ( 1 ) la ruta de MEP plastidio proporcionar IPP y DMAPP , como precursores isoprenoides universales ; ( 2 ) los pasos de condensación producir aglicona , esteviol de IPP y DMAPP , y ( 3 ) la glicosilación de ceder esteviol una mezcla de diferentes Comisiones de Estudio . A principios de vía del mevalonato se postula como una fuente exclusiva de esqueleto kaureno de SGS presentes en la stevia , pero más tarde , la implicación de la vía MEP se demostró que era responsable de la biosíntesis de SGS [ 12 , 13 ] .

Entre las varias enzimas de la vía MEP , la quinta enzima MDS (EC: 4.6.1.12 ) es crítico ya que cataliza la primera etapa de ciclación para convertir 4 - ( citidina 50 difosfo ) - 2C - metil-D - eritritol 2 -fosfato ( CDP - ME2P ) en 2C - metil-D - eritritol 2,4 - ciclodifosfato ( MECDP ) a través de ataque intra - molecular mediante un grupo fosfato en difosfato de la CDP- ME2P [ 14 ] . La proteína MDS homo - trimérica se ha demostrado que compartir tres sitios activos entre las copias adyacentes de la proteína y requiere Zn2 + y Mn2 + para su actividad [ 15 ,16 ] . En estudios in vitro utilizando la espectrometría de masa electro -spray seguido por análisis de RMN revelaron que MDS podrían obligar a los productos como IPP, DMAPP , difosfato de geranilo (GPP ) , y farnesil difosfato ( FPP ) , lo que sugiere la posible participación de MDS en el control del flujo de metabolitos a través de regulación de evaluación [ 17 ] . Además, MDS es una nueva diana terapéutica contra la malaria por Plasmodium falciparum [ 18 ] .

Anteriormente , se informó de la clonación de SrMDS de stevia y estudiamos su regulación en los distintos órganos, incluyendo las diferentes posiciones de hoja, y en respuesta a jasmo metil - nate, GA3 y kinetina [ 19 ] . SrMDS se encontró que era altamente expresado en el tejido de la hoja , en comparación con el vástago y tejidos de la raíz . La expresión de SrMDS era más alta en la primera hoja de nodo y disminuyó a partir de entonces . Sin embargo , no se informó de valida-ción funcional de SrMDS y también no se informó de la regulación de la expresión del gen con referencia a otras señales que modulan la biosíntesis de isoprenoides . Por ejemplo , los genes de la ruta de MEP son reportados a ser modulada por las auxinas , ácido abscísico (ABA ) , y la luz [ 20 , 21 ] . El presente trabajo se estableció funcionalidad de SrMDS y mostró el papel de la luz y el ácido 3 - indol-acético ( IAA ) en la regulación de la expresión de SrMDS .

Materiales y métodos

Material vegetal y condiciones de crecimiento

Las plantas de S. rebaudiana , bien mantenidos en la granja experimental de nuestro instituto (latitud 32°06’ 20” N , longitud 76° 33’ 29” E y altitud 1300 msnm ) , fueron elegidos para diversos estudios. Para el estudio de la expresión génica bajo la luz y la oscuridad, tercera hoja ( posición de la hoja se define con referencia a la hoja apical como la Primera hoja ) se cosechó a las 06:00 h , 10:00 h , y 20:00 h y se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 C , hasta su uso posterior . Las intensidades de luz en el campo fueron medidos usando un medidor de luz ubicado en un analizador de gases infrarrojo ( IRGA ; LI -6400 , Li -COR Instruments, EE.UU. ) .

análisis Bioinformática

Punto isoeléctrico teórico y el peso molecular de la proteína deducida se calcularon con el cálculo pI / Mw herramienta ExPASy ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) . Un árbol filogenético fue construido usando MEGA 5.0 programa ( http://www.megasoftware.net ) basado en el método vecino de unión de [ 22 , 23 ] . La fiabilidad del árbol se midió por análisis de arranque con 1000 repeticiones [ 24 ] . Estructura secundaria de las secuencias de aminoácidos deducidas se predijo por el método de predicción de auto - optimizado con la alineación ( SOPMA ) ( http://npsa-pbil.ibcp.fr/ ) [ 25 ] .

ensayo de complementación

Ensayo de complementación se realizó en la cepa mutante de Escherichia coli en la que EB370 MDS ha sido eliminada y condicionalmente complementa a través de la integración de los SMD en el locus araBAD bajo el control del promotor inducible por arabinosa - araBAD [ 26 ] . La región de codificación ( 696 pb) de SrMDS se amplificó usando el cebador 50 -ATGGC- TACTTCTTCGTCGTGTTACACCT -30 y reverso pri -mer 50 -TTATTTCTT CATCAACAGCACAACCGTG - 30 . El amplicón se clonó en pQE - 30 UA vector de expresión ( Qiagen , Alemania ) . La expresión resultante plásmido pQE - SrMDS se transformó en EB370 tensión y selecciona en medio Luria - Bertani ( LB ) que contiene glucosa , (en lugar de arabinosa ) , antibióticos ( 25 lg / ml kanamicina y 100 lg / ml ampicilina) , y 0,5 mM isopropílico BD- 1 - tiogalactopiranósido (IPTG ) . Presencia de pQE - SrMDS plásmido de colonias supervivientes se verificó mediante reacción en cadena de la polimerasa ( PCR; . Figura 1 complementario ) mediante pQE - 30 primers específicos con vectores UA ( cebador , CCCGAAAAGTGCCACCTG y GTTCTGAGGTCATTACTGG cebador inverso). La clonación direccional de genes fue confirmada por secuenciación BigDye con ter - minator v 3.1 ciclo de secuenciación de mezcla ( Applied Biosystems , Foster City , CA ) en un secuenciador automático de ADN ( ABI Prism 3130xl , Genetic Analyzer , Applied Biosystems ) siguiendo las instrucciones del fabricante . La expresión de la proteína recombinante fue inducida por IPTG 1 mM disuelto en agua estéril y se añade a la de cultivo líquido de EB370 . Las células se recogieron a las 12 h y la expresión de las proteínas recombinantes se comprobó mediante SDS – poliacrilamida electroforesis en gel y tinción con Azul Brillante de Coomasie . Una transformación EB370 de control de la cepa se llevó a cabo con vacío vector pQE - 30 y seleccionada en placas de agar LB que contenían los antibióticos anteriores y 0,2 % arabi - nariz . Los transformantes se replicaron en placas de agar LB que contenían 25 lg / ml de kanamicina , 100 lg / ml de ampicilina , y 0,2 % de glucosa .

La exposición de la stevia a la luz

Las plantas en maceta se desplazaron desde la granja experimental de la cámara de crecimiento de la planta se mantuvo a 25 ± 2 ° C (16 h fotoperíodo ; fotosintética

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