Microbiologia

ACTIVIDAD PRÁCTICA Nº 7

PROPIEDADES BIOQUÍMICAS DE LAS BACTERIAS.

Definiciones

1.- Pruebas bioquímicas: conjunto de tests utilizados para detectar alguna propiedad fisiológica o bioquímica de un microorganismo, constituyendo una herramienta muy importante para su clasificación.

Las propiedades bioquímicas son las características más puntuales de los microorganismos, ya que evidencian la existencia de enzimas o metabolitos de las vías metabólicas, que a su vez son la expresión de un determinado gen del DNA.

2.- Enzimas: proteínas altamente especializadas encargadas de catalizar reacciones químicas

3.- Endoenzimas: enzimas intracelulares cuya función es catalizar reacciones, tanto de síntesis como de degradación.

4.- Exoenzimas: enzimas extracelulares que son excretadas a través de la pared celular al medio ambiente, para catalizar reacciones de degradación de macromoléculas. Ej: enzimas hidrolizantes

Propiedades bioquímicas de las bacterias:

La fisiología bacteriana comprende procesos tan complejos como la obtención de energía por fotosíntesis o quimiosíntesis, nutrición, ciclos de transformación de elementos de primordial importancia en el equilibrio vital, tales como nitrógeno, carbono y azufre, cromogénesis, etc.

Desde el punto de vista práctico de demostraciones de laboratorio, estudiaremos sólo los fenómenos de desdoblamiento de las sustancias nutritivas y las propiedades bioquímicas de las bacterias, es decir, la demostración de estos procesos enzimáticos en los medios diferenciales, que facilita en gran forma el diagnóstico bacteriológico.

Las enzimas microbianas que nos interesan desde el punto de vista de las propiedades bioquímicas de las bacterias se dividen en:

1- Hidrolizantes:

- Amilolíticas, sacarolíticas o fermentativas: Lactasa, celulasa, amilasa, sacarasa

- Proteolíticas: Proteasas, caseasas, gelatinasas.

- Lipolíticas: Lipasas.

2- Reductoras y Oxidantes: Reductasas y oxidasas.

3- Coagulantes: Coagulasa o fermento lab. coagulasa sanguínea.

4- Citolíticas: Hemolisinas, leucocidinas.

A.- Exoenzimas hidrolizantes:

1.- Enzimas amilolíticas: descomponen o hidrolizan los hidratos de carbono en forma parcial o total.

Los hidratos de carbono existen en la naturaleza en forma de polisacáridos tales como el almidón o la celulosa, que son moléculas demasiado grandes y complejas para ser asimiladas por los microorganismos. El desdoblamiento de los polisacáridos da como resultado la reducción del tamaño de estas moléculas, hasta que éstas sean tan simples que puedan ser transportadas al interior de la célula bacteriana.

1.- Hidrólisis de Almidón: El almidón es una macromolécula (unidades de glucosa) que necesita una hidrólisis previa para ser utilizado por los microorganismos. Con esta prueba se detecta la enzima amilasa que hidroliza el almidón en glucosa y restos de maltosa. Esta enzima se encuentra en numerosas bacterias saprófitas y patógenas (ej.: Bacillus subtilis, Salmonella, etc.).

Procedimiento: Se prepara agar nutritivo y se le agrega almidón al 1%. Una vez solidificado se siembra en grilla y se procede a incubar por 48 horas. Después de este tiempo se realiza la lectura de la prueba agregando lugol directamente a la placa. La reacción típica del almidón con el lugol es la formación de una coloración azul-parda.

Resultados: Un halo incoloro alrededor del crecimiento indica la hidrólisis del almidón, y por lo tanto, el microorganismo es amilasa positivo.

Si existe una coloración azul-parda alrededor del crecimiento significa que el almidón no ha sido hidrolizado por el microorganismo, debido a que no posee la enzima y por lo tanto es amilasa negativo.

Positivo Negativo

2.- Enzimas proteolíticas: descomponen o hidrolizan proteínas naturales como la gelatina. Ésta, al igual que los polisacáridos, es una molécula demasiado grande para penetrar en la célula bacteriana, por lo que primero debe ser degradada hasta polipéptidos y finalmente hasta los aminoácidos, que entrarán en la célula. La degradación de proteínas tiene por finalidad la utilización de nitrógeno para el crecimiento bacteriano, sin embargo, la propiedad de elaborar enzimas proteolíticas de gran actividad se limita pocas especies bacterianas, entre las que destacan algunas del género Clostridium, seguido por los géneros Bacillus, Proteus y Pseudomonas.

2.- Hidrólisis de Gelatina: La gelatina, proteína de estructura sencilla, es un colágeno desnaturalizado que tiene poco valor nutritivo, pero se usa para detectar la actividad proteolítica. Con este test se determina la capacidad de un organismo para producir enzimas de tipo proteolítico; las gelatinasas, que licúan la gelatina.

Procedimiento: Se prepara un medio de agar nutritivo y se agrega gelatina al 1%. Se funde y luego se esteriliza en autoclave y se distribuye en placas. Cada placa se siembra igual que en la prueba del almidón y se incuba por 48 horas.

La lectura se realiza agregando a la placa el reactivo de Frazier que contiene Cloruro de Mercurio, HCl y agua destilada.

Resultados: Una halo incoloro alrededor del crecimiento indica la hidrólisis de la gelatina, y por lo tanto el microorganismo es gelatinasa (+).

Si existe formación de un precipitado blanco alrededor del crecimiento se considera negativo, ya que esto corresponde a la reacción de la gelatina con el reactivo de Frazier, lo que indica que el microorganismo no posee la enzima gelatinasa.

Positivo Negativo

3.- Prueba con Agar Hierro Kliger: permite determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar un hidrato de carbono específico incorporado a un medio de crecimiento básico con producción con producción de ácidos. También permite detectar la producción de gas y/o de SH2 . El medio contiene lactosa al 1% y glucosa al 0,1%, peptonas, citrato férrico, tiosulfato de sodio y rojo fenol como indicador de pH. La detección de ácidos se detecta por el viraje del indicador, de rojo a amarillo (acidez)

Para distinguir entre la producción de ácidos a partir de ambos azúcares, el medio tiene lactosa 10 veces mas concentrada que la glucosa, por lo que la bacteria no la puede agotar, además el medio está inclinado en pico de flauta , lo que permite que la siembra se realice en picadura (parte recta del tubo) y en estría (en pico de flauta).

La producción de SH2 se genera a partir del tiosulfato de sodio cuando se combina con el citrato férrico, originando súlfuro de fierro, que se observa como un precipitado negro. Finalmente, lo gases se visualizan por la fractura o desplazamiento del agar en el tubo.

Procedimiento:

1) Inocular el tubo con una asa recta, haciendo una picadura hasta el fondo del tubo y a continuación una siembra en estrías en la superficie del pico de flauta.

2) Incubar a 37ºC durante 24 hrs.

3) Realizar la lectura observando el viraje del indicador (amarillo: acidez; fucsia: alcalinidad); precipitado negro (producción de SH2 y fractura o desplazamiento del agar (producción de gas)

Resultados:

Medio de cultivo sin inocular

4.- IMVIC: corresponde a 4 pruebas que se utilizan para la identificación de Enterobacterias.

a) Producción de Indol (I): permite determinar si la bacteria produce la enzima triptofanasa que hidroliza el triptofano produciendo indol, acido pirúvico y amoniaco. Para determinar la presencia de la enzima se utiliza un caldo peptonado (que contiene triptofano) y con la utilización del reactivo de Kovacs se detecta la producción de indol

Procedimiento:

- Con el asa de loop, tomar un inóculo de un cultivo de 24 hrs de incubación e inocular el caldo peptonado

- Incubar a 37ºC durante 48 hrs

- Con un gotario agregar 5 gotas de xilol, agitar y luego 5 gotas del reactivo de Kovacs y agitar suavemente

Resultados:

- Positivo: formación de un anillo rosa a rojizo en la superficie del medio. El microorganismo produce la enzima triptofanasa

- Negativo: formación de un anillo amarillo en la superficie del medio. El microorganismo no produce la enzima triptofanasa

b) Rojo Metilo (RM): permite determinar si el microorganismo realiza fermentación acido mixta de la glucosa ( Producción de mas de un ácido orgánico, como fórmico,, acético, láctico y succínico) y etanol. La liberación de ácidos orgánicos generará un descenso del pH que podrá ser detectado añadiendo al medio el indicador de pHl rojo de metilo (rojo a pH 4.0). Además se puede detectar la producción de gas colocando una campana Dirham en el tubo

Procedimiento:

- Con un asa de loop tomar un inóculo de un cultivo de 24 hrs de la cepa a estudiar e inocular un tubo con medio

- Incubar a 37ºC durante 48 hrs

- Agregar sobre el cultivo 5 gotas del indicador rojo de metilo

Resultados:

- Positivo: el cultivo es lo suficientemente ácido como para permitir

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